Многопараметрическая оптическая визуализация всего сердца выявляет зависящую от пола гетерогенность в передаче сигналов цАМФ и кинетике реполяризации

Экспрессия кардиоспецифического биосенсора цАМФ у мышей

Для оценки симпатических сигнальных реакций в интактном сердце мы использовали условную репортерную мышь CAMPER (22), экспрессирующую биосенсор цАМФ, опосредованный Epac на основе FRET (рис. 1, A и B) (23). Для получения кардиоспецифической экспрессии мы скрестили условную репортерную мышь CAMPER с мышью, экспрессирующей тяжёлую цепь α-миозина с Cre (рис. 1B) (24). Сначала мы проверили способность CAMPER сообщать об активности цАМФ в изолированных желудочковых миоцитах. Свежеизолированные желудочковые миоциты от кардиоспецифических мышей CAMPER демонстрировали интенсивную флуоресценцию цианового флуоресцентного белка (CFP) и жёлтого флуоресцентного белка (YFP) (рис. 1C). После фотообесцвечивания акцептора YFP мы наблюдали увеличение флуоресценции донора CFP на 15 ± 1,1%, что подтверждает эффективный перенос энергии между двумя флуоресцентными белками (рис. 1D). Для дальнейшей валидации биосенсора FRET, специфичного для кардиомиоцитов, к клеткам были добавлены активатор аденилатциклазы широкого спектра форсколин и ингибитор ФДЭ широкого спектра 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) для максимальной активации цАМФ (рис. 1, E–G). Применение форсколина + IBMX к миоцитам CAMPER увеличило соотношение FRET CFP/YFP на 41,4 ± 1,97% по сравнению с отсутствием препарата и применением форсколина + IBMX в кардиомиоцитах дикого типа (рис. 1G). Эти результаты подтверждают широкий динамический диапазон и жизнеспособность данного сенсора для оценки активности цАМФ в сердце мыши.